1. 絕大部分細(xì)胞消化的時(shí)候是只要用胰酶潤(rùn)洗一遍即可.吸去胰酶后,殘留的那些無(wú)法計(jì)算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細(xì)胞.對(duì)于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞,連續(xù)這樣傳代,對(duì)細(xì)胞傷害很大.簡(jiǎn)單的程序是PBS潤(rùn)洗吸去,胰酶潤(rùn)洗吸去,然后37℃消化.比較難消化的細(xì)胞(潤(rùn)洗方法5min還不能消化),這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育.

    2.細(xì)胞如何算是消化好了呢?不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了,一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層,只要能移動(dòng)了,多半呈沙壯移動(dòng),其實(shí)已經(jīng)可以了,很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打成*分離細(xì)胞,這是沒(méi)有必要的.一般能移動(dòng)了,說(shuō)明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了,細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了,細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了(雖然沒(méi)有呈現(xiàn)很廣的離散分布).這個(gè)時(shí)候應(yīng)該停止消化,不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好,間隙很大,才停止.細(xì)胞就是*成單個(gè)細(xì)胞懸液,之后在貼壁的過(guò)程中仍然會(huì)聚集,這個(gè)是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,尤其是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特性.如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致,那可能是自己沒(méi)消化好導(dǎo)致的,但如果消化方法正確,仍然成片分布,甚至*吹打成單細(xì)胞懸液,貼壁后仍然成片分布,這是細(xì)胞的特性,是因?yàn)橘N壁過(guò)程中重新聚集了.這個(gè)時(shí)候你拼了命要去讓它均勻分布,你的細(xì)胞之后會(huì)對(duì)你越來(lái)越不好.

    3.EDTA的作用.胰酶切割ECM的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白,而EDTA通過(guò)螯合Ca離子,作用于Integrin的活性,所以EDTA的作用更加溫和.有的人在胰酶里添加一些EDTA,或者對(duì)付特別難消化的細(xì)胞,添加多一些EDTA.

    4.PBS洗滌.消化之前用PBS洗滌,是常見(jiàn)的操作,因?yàn)檠逯泻幸种埔让傅牡鞍?對(duì)于一些難消化細(xì)胞,那么可以配制不含Ca,Mg離子的PBS,因?yàn)檫@些離子也會(huì)抑制胰酶的活性.但對(duì)于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤(rùn)洗即可消化的細(xì)胞,不需要配制如此溶液.